陸光祖，字與繩，平湖人。祖父陸淞，父親陸杲，都是進士。陸淞任光祿卿。陸杲任刑部主事。陸光祖十七歲時，與父親同時在鄉試中舉。不久考中嘉靖二十六年(1547)的進士，授職為睿縣知縣。兵部尚書趙錦發布命令讓京郊的百姓修筑邊墻，陸光祖稱不利。趙錦惱怒，彈劾他。陸光祖向巡撫陳述，請求發放雇工費，百姓才安定。郡王搶奪民產，陸光祖依法加以制裁。
他調任南京禮部主事，因急事請假回鄉。回任后補祠祭主事，歷任儀制朗中。嚴訥任尚書，向來器重陸光祖，他的提議沒有不批準的。等到嚴訥改任吏部職，調陸光祖擔任驗封郎中，又改任考功郎中。王崇古、張瀚、方逢時、王一鶚為輿論困擾，陸光祖極力替他們洗刷。不久他改任文選郎中，更加盡職發掘人才，對那些素有威望的士大夫盡數選用。又破格提拔廉潔、能干的官吏王化、江東、邵元善、張澤、李珙、郭文通、蔡琮、陳永、謝侃。他們或者是由鄉里舉薦的貢士，或者是由書吏中提拔。因此下層官吏競相勉勵，嚴訥也全力任用他，所以陸光祖能夠實現意愿。左侍郎朱衡懷恨陸光祖，在背后議論，御史孫丕揚就以專權之罪彈劾陸光祖。當時他已調任太常少卿，被撤職閑居。
大學士高拱掌管吏部，謀劃傾覆徐階。徐階的賓客都躲避了，唯獨陸光祖替他申辯。等到高拱罷職，楊博代替他負責吏部，認為他仗義，特意啟用陸光祖為南京太仆少卿。還沒上任，就升任本寺卿。不久又升任大理寺卿。半路上聞報父親去世，回家奔喪。萬歷五年(1577)出任原職。張居正因為居喪未滿奪情出任官職，杖責議論的人，陸光祖送信規勸他。等到王用汲彈劾張居正，張居正即將重懲他時，當時任大理寺卿的陸光祖極力解救使他幸免。張居正與陸光祖同年考取進士，相互友好，想引薦他做助手，陸光祖不屈身相隨。等到他調任工部右侍郎，因為議論漕運改為折色銀兩而違逆了張居正，御史張一鯤疏論他，陸光祖就稱病回鄉了。
萬歷十一年(1583)冬天，他被舉薦擔任南京兵部右侍郎。才過十來天，就召任他為吏部職。他把張居正所摒棄的老成人全部召回安排在九卿各部中，安置了很多人。李植、江東之極力請求治張居正的罪，陸光祖稱張居正輔佐的功績不可抹殺，與輿論相反。李植等人因為丁此呂以前攻擊尚書楊巍，陸光祖支持楊巍詆毀議論的人，議論的人于是群起攻擊陸光祖，他由左侍郎出任南京工部尚書。御史周之翰彈劾陸光祖依附同族的人陸炳得到清高顯貴的官職，神宗不理會。御史楊有仁就彈劾陸光祖收受賄賂，請求將他交給官吏治罪，楊巍極力保護他，事情得以平息，陸光祖最后稱病離職。
萬歷十五年(1587)，他出任南京刑部尚書，改派到吏部。率領同僚彈劾東廠太監張鯨，并且請求寬恕李沂。此后，稱皇儲未定，是因為張鯨搞陰謀，請求清除他以便安定宗廟社稷。等到神宗召回張鯨，他又率領同僚極力勸諫。他入朝擔任刑部尚書。神宗曾將他的名字書寫于御屏上，吏部尚書宋纟熏去世，于是起用陸光祖代替，讓趙錦代替陸光祖的原職。御史王之棟稱他們兩人不應當任用，神宗惱怒，將王之棟降職為雜仆。當時部中的權力被內閣奪取了，宋纟熏極力矯正，遭受挫折，陸光祖不為驚懼。曾經因事與大學士申時行相抵觸。申時行不高興，陸光祖最終沒有順從。申時行辭職，神宗特意授旨起用趙志皋、張位，都是申時行暗中推薦的。陸光祖稱，輔佐大臣應當由朝廷推薦，不應當由宮內降旨。皇上這次的命令應下不為例。
萬歷二十年(1592)全面考察地方官吏，給事中李春開、王遵訓、何偉、丁應泰，御史劉汝康都先在京城之外任過職，名聲不好，全部被罷黜。又舉薦許孚遠、顧憲成等二十二人，當時的輿論一致稱贊。不久，因為推舉饒申、萬國欽與圣旨抵觸，文選郎王教以下的人全被驅逐。陸光祖稱事情的起因在自己，告罪請求退休，為郎官請求寬恕，神宗沒有批準。等到推舉內閣大臣，朝廷大臣遵循舊例，首先報上陸光祖的姓名。神宗下詔答復：“你先前請求朝廷推舉，推舉的原來首先就是你。”陸光祖知道皇上不容忍自己，每天都懷藏離去的打算。不久，因為王時槐、蔡悉、王樵、沈節甫等德高望重，特別推薦給皇上，給事中喬胤就彈劾陸光祖和文選郎鄒觀光。陸光祖就極力請求離去，神宗允許他乘坐驛車，回鄉五年后去世。被贈封為太子太保，謚號莊簡。
陸光祖為人耿介有骨氣，見識高明，通曉朝廷典制，每當議論大政方針，他一言確定要害。
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